Николай Петрович родился 17 января 1820 года в Ярославле в семье Петра Матвеевича Пастухова. С детства жил в доме, расположенном ныне на улице Пушкина, где впоследствии размещалась Кировская поликлиника. В семье помимо него были младший брат и две сестры. Получил домашнее образование, уже с 12 лет начал изучать торговые операции, исполняя разные коммерческие поручения.
Ощущая недостаток знаний, полученных в детстве и юности, всю свою сознательную жизнь Николай Петрович очень много читал. Благодаря огромной любви к книге, купец Пастухов прекрасно знал русскую литературу, получал все выходившие в 40-х и 50-х годах русские журналы.
Пастуховы были крупными домовладельцами. Основную массу ярославских владений Пастуховых составляли доходные дома: торговые дома, лавки, склады в центральной торговой части города, а также жилые усадьбы. Благотворительность Пастуховых выразилась не только в пожертвованиях крупных сумм на содержание и расширение Ольгинского приюта, Дома трудолюбия, библиотеки-читальни, но и в передаче городу под благотворительные цели домов. В середине XIX в. был передан под богадельню дом на улице Власьевской, в начале XX в. на Духовской улице построено техническое училище. На Большой Даниловской улице Пастуховы в начале XX в. содержали странноприимный дом.
Став единственным наследником после смерти отца в 1845 году, овладел чугуноплавильными заводами на Урале, мукомольными заводами, лавками Нижегородской ярмарки. Был в компаньонстве с дядей, Александром Матвеевичем, с которым в 1864 году он основал Торговый дом «А. и Н. Пастуховы». За короткое время, благодаря умелому ведению дел, постоянному расширению сфер сбыта товаров, выгодным сделкам, дешёвой рабочей силе им удалось удвоить свой капитал и приобрести новые предприятия. Торговый дом прекратил своё существование со смертью дяди и разделом его имущества между его детьми.
Николай Пастухов же продолжил приумножение своих средств. Николай Петрович внедрял на производстве различные технические новшества, старался ориентироваться не столько на отечественный опыт, сколько на мировые, особенно британские, передовые образцы. На свои заводы он приглашал хороших специалистов.
В 1885 году он приобрёл доли братьев в Вятских заводах, в 1892 году выкупил Сулинский завод у двоюродного брата Дмитрия Александровича, став единственным владельцем всех пяти семейных металлургических заводов с миллионными оборотами и наследственной торговли железом. К началу XX века склады и конторы по продаже железа, свинца, меди, олова и т. д. и изделий из них его торговой фирмы находились в Москве, Петербурге, Туле, Вятке, Ярославле и на Нижегородской ярмарке; главная же контора помещалась в Ярославле, где жил и сам Николай Петрович.
Пастухов был самым богатым среди ярославских купцов. В городе у него было больше десятка домов: доходные дома, лавки, склады в центральной торговой части города.
Несмотря на то, что Николай Петрович Пастухов имел только домашнее образование, он был человеком прогрессивных взглядов, не боялся нововведений, внедрял на производстве различные технические новинки.
В своей деятельности Николай Петрович старался ориентироваться не только и не столько на отечественный опыт коммерции, сколько на самые передовые образцы своего времени, прежде всего, на англичан. Только их он признавал по-настоящему деловыми людьми. Н.П.Пастухов интересовался всем британским и даже получил прозвище «ярославский англичанин». По-английски он старался организовывать и свою домашнюю жизнь (лакеи, камердинеры, др.).
Осознавая, как трудно получить хорошее образование детям из необеспеченных семей и как сильно нуждается российская промышленность в квалифицированных кадрах, Николай Петрович Пастухов и задумался об открытии технического училища. В 1895 году он публично объявил о своем замысле: «создать училище, имеющее целью, наряду с обучением столярному и слесарному производству, сообщать учащимся знания и умения, необходимые ближайшим и непосредственным руководителям труда».
Журнал «Ярославские зарницы» в 1900 году писал: «Вечный памятник по себе оставил Н.П. Пастухов основанием в Ярославле технического училища».
Именно за этот бесценный дар родному краю Николай Петрович Пастухов был возведен в потомственное дворянское достоинство.
Николай Петрович был заметной фигурой в общественной жизни Ярославля.
Он начал свою карьеру общественного деятеля со службы в 1851—1853 годах в совестном суде, в 1851—1865 годах — экономом в богадельне для призрения престарелых и увечных людей на 50 человек, содержавшейся на деньги Пастуховых и получившей название «Пастуховская», состоял её попечителем до самой смерти. Так, например, только на ее ремонт и расширение он истратил до 20 тысяч рублей.
Трижды избирался почётным мировым судьей по Ярославскому уезду. В 1871—1895 годах — гласный Ярославской городской думы. Состоял членом Общества для пособия нуждающимся переселенцам, попечителем Александровского дома призрения для мальчиков-сирот, почётным членом Губернского попечительства детских приютов, членом-благотворителем ярославского комитета Попечительства Императрицы Марии Александровны о слепых, почетным членом Общества для содействия народному образованию и распространению полезных знаний в Ярославской губернии.
Жертвовал крупные суммы на благотворительные цели: устройство сиротского отделения для постоянно живущих воспитанниц Ярославского Ольгинского детского приюта, строительство амбулатории при лечебнице Ярославского Общества врачей, больницы при Сулинском заводе, храма Александра Невского в Сулине (ныне не существует); учреждение Дома трудолюбия, библиотеки-читальни.
В 1900 году выделил четверть своих средств на открытие в Ярославле низшего механико-технического училища с ремесленной школой при нём на 240 учащихся — первого учебного заведения в городе для подготовки квалифицированных кадров для промышленности; были построены здания, оборудованы классные помещения и мастерские, для учеников и педагогов были предусмотрены бесплатные квартиры. Ныне это Ярославский промышленно-экономический колледж (с 1972 года располагается в других зданиях).
За общественную и благотворительную деятельность Н.П.Пастухов был награжден двумя золотыми медалями с надписью «За усердие» для ношения на шее на Владимирской и Аннинской лентах и орденами Святой Анны 2-й и 3-й степени и Святого Станислава 3-й степени. Но самым крупным и значимым его деянием было создание им на свои средства в Ярославле нижнего механико-технического училища и при нем ремесленной школы на 240 учащихся, строительство для них зданий и оборудование в них «роскошных» классных помещений и мастерских. За этот вклад в образование Николай Петрович возведен в «потомственное дворянское Российской Империи достоинство».
В 1900 году ярославский купец Николай Петрович Пастухов был избран почетным членом Общества для содействия народному образованию и распространению полезных знаний в Ярославской губернии. За строительство училища и амбулатории, на которые Н.П. Пастухов израсходовал более 700 тысяч рублей, в 1904 году ему было присвоено по решению Городской Думы звание почетного гражданина города Ярославля. В ответном благодарственном письме Николай Петрович отмечал, что «интересы родного нашего города» для него «всегда были дороги».
Николай Петрович Пастухов скончался 5 декабря 1909 и был похоронен на Леонтьевском кладбище города Ярославля.
С 1973 года в бывшем здании механико-технического училища находится Академия промышленного менеджмента, которой присвоено имя Н.П. Пастухова, в ней с 1995 года проводятся Пастуховские чтения, направленные на освещение новаций в образовании, содействующих росту конкурентоспособности и эффективности предприятий и организаций.
Издано 3 книги о нем. В 2007 году в Музее истории города Ярославля состоялась пресс-конференция и открытие выставки «Верой и правдой городу», посвященной Н.П. Пастухову.